Diazepam Prodrug; plasma enzymes; As an inactive prodrug, Avizafone itself has no intrinsic activity at benzodiazepine receptors. Its primary target is the enzymatic cleavage site of aminopeptidases (specifically Aminopeptidase B) in the bloodstream. Upon enzymatic conversion, it releases the active metabolite, diazepam. Diazepam then acts as a positive allosteric modulator of the GABAA receptor, enhancing chloride ion channel opening to produce sedative, anxiolytic, and anticonvulsant effects .
Avizafone Dihydrobromide targets the central nervous system through its active metabolite diazepam. As a prodrug, it is metabolized by plasma enzymes to release diazepam, which then acts as a positive allosteric modulator of the GABA-A receptor. Diazepam enhances the inhibitory effects of GABA in the brain, producing anxiolytic, anticonvulsant, and muscle relaxant effects. The prodrug form provides water solubility for parenteral administration, making it suitable for emergency use as an antidote.

人氨肽酶B (APB) 是一种不稳定的酶，目前正被研究作为鼻内给药前药/酶复合物的生物催化剂。因此，APB的稳定性是确保药物产品有效性的关键因素。冻干是延长酶保质期的常用技术之一。然而，冻干过程本身会导致构象变化和聚集，从而导致酶失活。本研究展示了使用地西泮前药阿维扎芬 (AVF) 作为稳定剂，以最大程度地减少冻干过程中APB的失活。将APB样品与AVF、海藻糖和/或甘露醇组合，进行速冻和冻干，随后复溶以测定APB的活性。在所有配方组合中，APB + AVF + 海藻糖的组合表现出最低的降解率，活性保留率达到71%。随后，APB + AVF 和 APB + 海藻糖的活性保留率分别为 60% 和 56%。相比之下，APB + 甘露醇和单独的 APB 的活性保留率分别仅为 16% 和 6.4%。APB + AVF + 海藻糖制剂的冻干物进行了为期 6 个月的加速稳定性研究，结果显示活性几乎没有降低。这些结果表明，酶与其底物共冻干可以赋予其与常用冻干保护剂海藻糖相当的稳定性，但底物和海藻糖的组合比单独使用任何一种添加剂都具有更好的稳定效果 [1]。

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在体外，二氢溴酸阿维扎芬经血浆酶代谢释放活性药物地西泮。该化合物的活性通过使用高效液相色谱 (HPLC) 或液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 等分析技术测量血浆或血清样本中地西泮的生成速率来评估。该化合物被用作模型化合物，用于研究苯二氮卓类衍生物的水解和取代反应。其水溶性使其区别于水溶性差的地西泮。

鼻内给药是小分子亲脂性药物全身给药的一种理想途径，因为这类药物能迅速经鼻黏膜吸收进入体循环。然而，亲脂性药物溶解度低，常常限制了水性鼻喷雾剂的制备。一种独特的克服溶解度问题的方法是将亲水性前药与外源性转化酶联合给药。这种策略不仅解决了溶解度差的问题，还能增加驱动药物吸收的化学活性梯度。本文中，研究人员报告了在给予亲水性地西泮前药Avizafone与转化酶人氨肽酶B后，大鼠血浆和脑组织中的药物浓度。分别经鼻内给予相当于地西泮剂量0.500、1.00和1.50 mg/kg的Avizafone，其生物利用度分别为77.8% ± 6.0%、112% ± 10%和114% ± 7%；血浆峰浓度分别为71.5 ± 9.3、388 ± 31和355 ± 187 ng/ml；各剂量组达到血浆峰浓度的时间分别为5、8和5分钟。地西泮和一种短暂存在的中间体均被吸收。将酶动力学纳入基于生理的药代动力学模型，可以估算出地西泮和中间体的吸收速率常数分别为：0.0689 ± 0.0080 分钟⁻¹ 和 0.122 ± 0.022 分钟⁻¹。我们的结果表明，几乎不溶于水的地西泮可以通过鼻内给药快速且完全吸收，这得益于与氨肽酶 B 联合使用阿维扎芬。此外，只需提高酶浓度即可获得更快的吸收速率，这有可能取代静脉注射地西泮或劳拉西泮，或肌注咪达唑仑，用于治疗癫痫发作[2]。在体内，阿维扎芬二氢溴酸盐代谢为地西泮，后者具有抗惊厥和抗焦虑作用。该化合物主要用作有机磷神经毒剂中毒的解毒剂。在紧急情况下，这种水溶性前药可通过肠外途径给药，迅速达到地西泮的治疗浓度。该化合物治疗有机磷中毒的疗效归功于地西泮的抗惊厥特性。

酶动力学。[1]
在pH 7.4的PBS缓冲液中，于32°C下，通过拟合不同AVF浓度下的初始底物消耗速率，测定了APB水解阿维扎芬(AVF)的米氏常数(KM)和最大反应速率(Vmax)。反应在Eppendorf Thermomixer 5436恒温混匀仪中进行，转速为500 rpm，反应体系中阿维扎芬(AVF)浓度为62.5–4000 μM，APB浓度为15 μg/mL (0.203 μM)。反应1分钟后，加入甲醇使APB变性。在用Cary 100 Bio-UV/Vis分光光度计测量淬灭反应混合物的紫外光谱之前，待ORI环化生成DZP的反应完成。采用 338 nm 波长处光谱的二阶导数对地西泮 (DZP) 进行定量，其以消耗的阿维扎芬 (AVF) 的摩尔当量表示。

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冷冻干燥步骤 [2]
将 APB、阿维扎芬 (AVF)、Tre、Man、pH 7.4 Tris 缓冲液和纯水的水溶液储备液在冰浴中冷却至约 0°C。用移液管将储备液按适当比例分装到预冷的 2 mL 玻璃小瓶中，以达到所需的组分浓度，并确保每个样品的最终体积相等。对于含有 AVF 的样品，最后加入 AVF 溶液。将预冷的溶液用移液管短暂混匀，然后将小瓶浸入液氮中 5 分钟，以快速冷冻内容物。将样品瓶从液氮中取出，转移至冻干瓶中，使用 FreeZone 6 型歧管式冻干机在室温下于 0.016 mbar 的真空条件下干燥 18 小时。将装有冻干物的样品瓶密封后，置于干燥器中保存，直至进行分析。除非另有说明，否则均假定在室温下保存。

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活性酶测定[2]
采用光谱技术测定样品处理、冻干和保存后剩余的活性酶量。使用配备温度控制器的 Cary 100 Bio-UV/Vis 双光束分光光度计进行吸光度 (Abs) 测量，以追踪底物水解情况。除非另有说明，温度控制器设置为 32°C，即人鼻腔的平均温度。样品在光程为 1 cm、最小填充体积为 50 μL 的石英超微量比色皿中进行分析。本研究中使用的APB、Tre、Tris和Man溶液在用于光谱定量分析底物和产物浓度的波长下均为透明溶液。为测定酶活性，将冻干粉用1.00 mM LpNA在32°C加热的PBS缓冲液中复溶。将所得溶液立即转移至已置于分光光度计温控模块中的比色皿中。监测LpNA水解引起的405 nm处吸光度的变化。每100毫秒读取一次吸光度值。利用前0.25分钟内吸光度变化的斜率(dAbs/dt)计算反应速率(d[pNA]/dt)，如下所示：
其中ε代表摩尔吸光系数。在 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中，32°C 下，405 nm 波长处的 εpNA = 9860 M⁻¹ cm⁻¹，εLpNA = 55.9 M⁻¹ cm⁻¹（ε 的温度依赖性见补充信息表 S1）。比酶活性计算公式为 (d[pNA]/dt)/[APB]。显色底物 LpNA 不能用于测定含有前药底物阿维扎芬 (AVF) 的样品中活性 APB 的含量。为了测定这些样品中活性 APB 的含量，将冻干粉用 100 μL PBS 缓冲液或 1.00 mM 阿维扎芬 (AVF) 的 PBS 溶液（已加热至 32°C）复溶，并将所得溶液立即转移至分光光度计的比色皿中，如上所述。监测 20 分钟内 AVF 转化为 DZP 引起的 315 nm 处吸光度的变化。每 0.25 分钟读取一次吸光度值。t 时刻 DZP 的浓度计算如下：
其中 Abs₀ 为样品的初始吸光度，Absₜ 为 t 时刻测得的吸光度。在 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中，32°C 时，315 nm 波长处的 εDZP = 2040 M⁻¹ cm⁻¹，ε阿维扎芬 (AVF) = 753 M⁻¹ cm⁻¹。εDZP 和 ε阿维扎芬 (AVF) 的温度依赖性，以及在根据吸光度测量值计算 DZP 浓度时忽略 εORI 的有效性，已在之前的研究中讨论过。获得地西泮浓度-时间曲线后，将以下耦合微分方程组拟合到数据，其中[APB]作为单独的拟合参数。

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阿维扎芬二氢溴酸盐的体外酶/受体结合试验通常测量其在血浆酶的作用下转化为地西泮。这些试验包括将该化合物与血浆或纯化酶孵育，并使用高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量地西泮的生成。评估水解速率并鉴定代谢物。该化合物也可用于苯二氮卓类药物水解和取代反应的研究。

虽然阿维扎芬主要在无细胞体系中进行酶动力学研究，但研究人员更关注其克服溶解度障碍的作用。在上皮细胞模型中，阿维扎芬与转化酶结合，形成过饱和药物溶液。这种浓度梯度迫使高浓度的地西泮穿过细胞单层，模拟鼻黏膜吸收中观察到的增强渗透现象。

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体外细胞实验用于评估阿维扎芬二氢溴酸盐转化为地西泮以及地西泮在GABA-A受体上的后续活性。用该化合物或其代谢物处理表达GABA-A受体的细胞，并通过电生理记录或钙成像测量受体激活情况。评估该化合物对神经元兴奋性的影响。这些实验证实了前药机制和释放的地西泮的活性。

对于鼻内给药，大鼠麻醉后仰卧，并进行插管。用于鼻组织切片的大鼠不进行插管。将溶于PBS的阿维扎芬(AVF)和APB溶液在给药前立即混合至每只动物所需的适当浓度。剂量水平见表1。混合后，使用带有凝胶加载吸头的Eppendorf移液器，将混合液快速注入鼻腔，深度为鼻孔后14 mm。总给药量为30 μl，0.5分钟内先向右侧鼻孔注入15 μl，再向左侧鼻孔注入15 μl。鼻内给药剂量分为四组：低剂量、中剂量和高剂量的阿维扎芬(AVF)/APB混合组，以及中剂量的阿维扎芬(AVF)单药组。选择这些剂量是因为在啮齿动物研究中，地西泮（DZP）的常用剂量接近 1 mg/kg，且在啮齿动物体内可达到具有临床意义的血浆浓度。[1]

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在啮齿动物模型中开展了阿维扎芬二氢溴酸盐的体内动物研究，以评估其作为有机磷中毒解毒剂的疗效。动物暴露于有机磷神经毒剂后，接受阿维扎芬二氢溴酸盐治疗。评估癫痫发作情况、存活率和神经系统预后。评估该化合物在脑内快速产生治疗浓度地西泮的能力。这些研究支持将其用作紧急解毒剂。

阿维扎芬是一种高效的药物递送载体。在人体试验中，注射阿维扎芬可使地西泮的血浆峰浓度（Cmax 231 ng/mL）高于等摩尔剂量的地西泮（Cmax 148 ng/mL），且达峰时间更快（Tmax 0.75 h vs 1.5 h）。在大鼠鼻内给药研究中，转化几乎是瞬时的，吸收半衰期以分钟计，表明其具有更高的生物利用度和快速的脑分布。

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阿维扎芬二氢溴酸盐的药代动力学特性在于其能被血浆酶快速转化为地西泮。作为一种水溶性前药，它适用于肠外给药。给药后，地西泮被释放并分布到中枢神经系统，在那里发挥其药理作用。地西泮在肝脏中广泛代谢，其代谢产物经尿液排出。前药形式可在紧急情况下迅速起效。

毒理学数据主要来源于其活性代谢物地西泮已知的安全性，局部耐受性除外。对大鼠鼻内给予阿维扎芬/APB制剂后鼻组织进行组织学检查，结果显示黏膜未出现急性损伤或病变。该前药策略避免了使用地西泮注射剂所需的有机溶剂（丙二醇、苯甲醇），从而可能减少局部刺激。

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阿维扎芬二氢溴酸盐是一种前药，可代谢为地西泮，地西泮是一种特性明确的苯二氮卓类药物，具有已确定的安全性和毒性特征。该化合物用作有机磷中毒的解毒剂，需在医疗监督下使用。与地西泮一样，潜在的不良反应包括镇静、呼吸抑制以及长期使用可能导致的依赖性。呼吸功能不全或重症肌无力患者应谨慎使用该化合物。

[1]. Diazepam Prodrug Stabilizes Human Aminopeptidase B during Lyophilization. Mol Pharm. 2020 Feb 3;17(2):453-460.
[2]. Intranasal Coadministration of a Diazepam Prodrug with a Converting Enzyme Results in Rapid Absorption of Diazepam in Rats. J Pharmacol Exp Ther. 2019 Sep;370(3):796–805.

Avizafen是一种肽类前药。总之，本文所呈现的药代动力学结果表明，鼻用复合制剂avizafen（AVF）和apiracetam（APB）是一种可行且快速的方法，可以将地西泮（DZP）送入系统循环，最终到达大脑。由于这种高浓度制剂不含有机溶剂，因此预计其耐受性会更好，吸收速度也会比使用溶剂的鼻用地西泮制剂更快。鼻用avizafen（AVF）/apiracetam（APB）作为一种非侵入性鼻喷雾剂，可以用于快速终止人类的癫痫发作，从而减少急诊就诊次数，提高癫痫患者的生活质量。进一步的研究进展需要开发一种能够将前药和酶分开存储，并在给药时混合成喷雾溶液的装置。[1] 最后，我们认识到，尽管本研究展示了底物对酶在冷冻干燥过程中稳定性的影响，但其范围仅限于APB。这些实验的主要目标是评估共同冻干avizafool (AVF)/APB组合的可行性，以稳定药物配方以便进一步的转化开发，并指导专用鼻用喷雾装置的设计要求。目前正在进行进一步实验，包括扩大到具有治疗相关浓度、优化冻干过程参数、全面表征冻干产品以及在输送装置中的性能测试。Avizafone二溴化物是一种水溶性地西泮前药，主要用作有机磷神经毒剂中毒的解毒剂。它通过血浆酶代谢释放活性药物地西泮，后者作为GABA-A受体的正变构调节剂。该化合物也被称为Prodiazepam二溴化物。它未获得常规治疗使用的批准，仅用于研究和紧急医疗应用。

C22H29CL3N4O3

592.75

429.1819195

60067-15-4

65617-86-9

71968

Typically exists as solid at room temperature

1.253g/cm3

697.6ºC at 760 mmHg

375.7ºC

1.604

4.347

122.01

3

5

10

30

583

1

NCCCC[C@@H](C(NCC(C(C1C=CC(Cl)=CC=1C(C1C([2H])=C([2H])C([2H])=C([2H])C=1[2H])=O)C)=O)=O)N

WQRZTXVDPVPVDN-MBABXSBOSA-N

InChI=1S/C23H28ClN3O3/c1-15(21(28)14-27-23(30)20(26)9-5-6-12-25)18-11-10-17(24)13-19(18)22(29)16-7-3-2-4-8-16/h2-4,7-8,10-11,13,15,20H,5-6,9,12,14,25-26H2,1H3,(H,27,30)/t15?,20-/m0/s1

(2S)-2,6-diamino-N-[3-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-oxobutyl]hexanamide

Avizafone Dihydrobromide; 60067-15-4; (2S)-2,6-diamino-N-[3-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-oxobutyl]hexanamide; N-[3-(2-Benzoyl-4-chlorophenyl)-2-oxobutyl]-L-lysinamide; Prodiazepam Dihydrobromide; (2S)-2,6-Diamino-N-(3-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-oxobutyl)hexanamide; L-Lysyl-N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-N-methyl-glycinamide Dihydrobromide; DTXSID20747061 Avizafone; 65617-86-9; Pro-diazepam; Avizafonum [INN-Latin]; Avizafona [INN-Spanish]; Avizafona; Avizafonum; Ro 03-7355/000;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

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